前面两期介绍了SMA疾病和基因，这一期我们来谈谈SMA的检测方法-MLPA。
MLPA原理
多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA)于年由Schouten等首先报道，是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，目前已经应用于多个领域、多种疾病的研究。
MLPA的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物通过毛细管电泳分离及数据收集，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链;反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在~bp。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
检测SMA最常用的MLPA试剂盒共有两款，P和P。
MLPA-P
P含有21个MLPA探针，其扩增产物在和nt之间，包括17个参考探针和4个检测探针，分别用于SMN1和SMN2的检测。
SMN1外显子7探针-L（nt）最重要，它可用于确定SMN1拷贝数。该探针特异于SMN1，并且在SMN2上不会发出重要信号。探针在外显子7的C-to-T转换处具有的连接位点可影响SMN2中RNA剪接的位点。
SMN1外显子8探针-L（nt）能够在外显子8（G到A转换）区分SMN1和SMN2。该探针的信号表示SMN1外显子8的拷贝数。在约95%的样品中，SMN1外显子7探针和SMN1外显子8探针检测到的拷贝数相同。该SMN1外显子8探针不能用于量化SMN1拷贝的数量，因为外显子8突变仍将产生功能性蛋白质。只应使用SMN1外显子7探针来确定SMN1拷贝数。在剩余的5%样品中的大多数中，SMN1和SMN2之间的基因转换产生了含有SMN1外显子7序列和SMN2外显子8序列的嵌合基因。这种杂合基因产生与SMN1蛋白功能相同的蛋白质。
SMN2外显子7探针-L（nt）识别SMN2拷贝数，这对SMA患者很重要，但对SMA携带者状态没有影响。
SMN2外显子8探针-L（nt）证实了在大多数个体中用SMN2外显子7探针获得的结果。如果该外显子8探针检测到的拷贝数与外显子7探针发现的拷贝数不一致，则只应使用外显子7探针确定SMN2拷贝数。
MLPA-P
P含有17个探针检测存在于SMN1和SMN2中的序列。
SMN1特异性外显子7探针-L（nt）和SMN2特异性外显子7探针-L（nt）是该混合物中最重要的探针。这两个探针区分了SMN1来自SMN2的连接位点在外显子7中这些基因之间的关键单核苷酸差异，可用于分别量化SMN1（对确定是否患病很重要）和SMN2（对疾病预后很重要）。
SMN1特异性外显子8探针-L（核苷酸）和SMN2特异性外显子8探针-L（核苷酸）区分SMN1和SMN2在外显子8G到A的过渡。在大约5-10%的情况下，由于基因转换，这些外显子8探针检测到的拷贝数与前述外显子7探针发现的拷贝数不对应。在这种情况下，只应使用外显子7探针来量化SMN1和SMN2拷贝数。
有7个SMN外显子7和8探针，可检测外显子7，内含子7和外显子8区域中SMN1和SMN2基因的组合拷贝数。在携带两份SMN1和两份SMN2的正常个体中，这些探针总共检测到四个基因拷贝。在纯合子SMN1的情况下删除时，这些探针可用于更准确地确定SMN2拷贝数。
10个SMN外显子1-6探针可用于鉴定具有这些外显子增益或缺失的患者样品以及具有两个SMN1外显子7序列但其中一个SMN1基因无功能的稀有携带者由于外显子1-6的缺失（Arkblad等人,;Thauvin-RobinetC等人,）。由于这些探针同时检测到SMN1和SMN2，因此这些探针检测到的外显子1-6缺失只有在个体临床背景下才能被认为是致病性的。请注意，许多健康人有额外的外显子1-6副本（SMN2Δ7-8）没有已知的临床意义。
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