KeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationofQinghai-TibetanPlateauinQinghaiProvince
OVERVIEW
Neuroscience(IF=3.)刊载了麦吉尔大学蒙特利尔神经病学研究所StefanoStifani团队（Email:stefano.stifani
mcgill.ca）发表的论文“CharacterizationofHumaniPSC-derivedSpinalMotorNeuronsbySingle-cellRNASequencing”(Publicationtime：22May,DOI:10./j.neuroscience..04.)。这项研究通过单细胞测序对不同的iPSC衍生的细胞类型进行了深度表型分析。前言TNTRODUCTION
人类诱导的多能干细胞（iPSC）已成为研究细胞分化、功能和功能障碍的强大模型系统，提供了从健康和患病个体生成特定细胞类型的机会，从而可以研究人类早期发育的机制，对多种人类疾病进行建模并促进新疗法的开发。基于人iPSC的应用通常受到源自单个供体的iPSC品系之间的变异性以及可衍生自iPSC的特定细胞类型之间异质性的限制。因此，对不同的iPSC衍生的细胞类型进行深度表型分析的能力至关重要。大约58％的人类iPSC衍生的MN显示出横向运动柱MN的分子特征，该MN组中存在许多分子上不同的亚群。大约19％的诱导MN与外轴运动柱MN相似，而6％的诱导MN具有中位运动柱MN的特征。脊髓运动神经元（MNs）是驻留在脊髓中并将神经轴突投射到肌肉纤维以控制其收缩的高度专业化的神经元。肌肉收缩的精确协调对于产生复杂的运动行为（如行走，抓握或呼吸）至关重要。在MN发育过程中，所有脊柱MN均来自MN祖细胞（pMN）域中的祖细胞。MN功能丧失与几种毁灭性神经系统疾病（包括脊髓性肌萎缩症（SMA）和肌萎缩性侧索硬化症（ALS））相关，并且它也是许多脊髓损伤病例的病理特征。鉴于脊髓MNs的异质性，对不同的h-iPSC衍生的MNs生物学特性的了解有限以及并非所有类型的hMN亚型都可能提供与疾病相关的实验模型的可能性，迫切需要提高对h-iPSC衍生的MN生物学和功能的了解。本研究有可能增进我们对iPSC衍生的MN亚型功能和功能障碍的了解，可能导致基于iPSC的人类MN生物学和疾病研究的应用得到改善。方法METHOD
1.从人iPSC产生运动神经元将低传代次数的人iPSC系NCRM-1（雄性）细胞在涂有Matrigel的6cm培养皿中的mTeSR培养基中培养，直到达到70-80％融合为止。为了生成神经祖细胞（NPC），用温和的细胞解离试剂将iPSC解离，并使用涂有PLO和层粘连蛋白的T25烧瓶进行分裂。将mTeSR培养基替换为化学成分明确的神经培养基，其中包括补充有GlutaMAX的DMEM/F12，神经基础培养基，N2（0.5x），B27（0.5x），抗坏血酸（lM）和抗生素-抗真菌药（1x）。该培养基补充有3lMCHIR、2lMDMH1和2lMSB。每隔一天更换一次培养基，持续6天，然后将所得的NPCs分化成运动神经元祖细胞（MNPCs），然后再分化为MNs。
在第6天，将NPC与GentleCellDissociation试剂解离，并与上述相同的培养基1：5分开，并补充视黄酸（RA）（0.1lM）和嘌吗啡胺（0.5lM）以及1lMCHIR，21MDMH1和21MSB试剂，每隔一天更换培养基。为了产生MN，将MNPC分离并以每孔50,个细胞的平板接种在Matrigel包被的盖玻片上，并在补充有0.5lMRA和0.1lM嘌呤吗啡的相同神经培养基中培养。每隔一天更换培养基。
2.通过免疫细胞化学表征人iPSC衍生的细胞
采用免疫细胞化学方法分析诱导的MNPC和MN，使用了以下一级抗体：小鼠抗OLIG2（1/）;兔抗PAX6（1/）;兔抗HOMEOBOXC4（HOXC4）（1/）;山羊抗SRY-BOX1（SOX1）（1/）；鼠标抗NK2HOMEOBOX2（NKX2.2）（1/）;兔抗HOMEOBOX蛋白质CHX10（CHX10）（1/10,）;小鼠抗HOMEOBOX蛋白质HB9（HB9）（1/30）;小鼠抗ISLET1（ISL1）（1/30）；兔抗LIMBHOMEOBOXCONTAINING3（LHX3）（1/），山羊抗FORKHEADBOX蛋白1（FOXP1）（1/）和豚鼠抗SCIP（1/16,）。为了量化，使用ZEN软件连接到AxioCam相机的AxioObserverZ1显微镜获取图像。对于每种培养物和每个时间点，使用20倍物镜拍摄3个随机视野中个细胞的图像，并使用图像J进行分析。表达特定标记蛋白的细胞比例以总细胞的百分比±平均值的标准误计算。3.从诱导的运动神经元培养物中制备单细胞悬液
从培养28天的MN中制备悬浮的单细胞。首先用2mL含0.04％BSA的dPBS（不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水）冲洗MN，然后用2mL含有木瓜蛋白酶（50U）和Accutase的解离试剂解离。将解离试剂中的细胞在37℃下孵育15–20分钟，以确保解离细胞簇，然后添加5mL含0.04％BSA和10％ROCK抑制剂Y（1/0）的DMEM/F12，然后通过轻轻移液重悬。将悬浮液中的细胞转移至15mL离心管中，并在室温下以rpm离心3分钟。将细胞沉淀重悬于2mL含0.04％BSA和ROCK抑制剂（1/0）的dPBS中。在室温下将细胞再次以rpm离心3分钟，并将细胞沉淀重悬于lL上述重悬缓冲液中。使用30μm的过滤器除去细胞碎片和团块，并将单细胞悬液转移至置于冰上的2mLEppendorf管中。在sc-RNAseq之前对细胞计数以评估细胞浓度和生存力。目标细胞浓度为–细胞/lL。
4.单细胞RNA测序和计算机分析
使用平台10xGenomicsChromiumSingleCell30Solution（10xGenomics）在单细胞水平上对细胞进行测序，然后在HiSeq4系统上进行测序。10xcDNA文库的测序深度为每个细胞50,个读数。所有软件包均可在Bioconductor项目上公开获得。
结果RESULT
1.人类iPSC衍生的运动神经元的丰富种群的产生脊髓MNPC由h-iPSCNCRM-1系通过模仿体内MN发育的体外顺序步骤（包括神经诱导），然后对NPC进行碱化和腹膜化而生成。脊髓鼻咽癌是由抑制骨形态蛋白质/转化生长因子-β信号诱导的，使用的是由骨形成的小分子混合物。如前所述使用CHIR，DMH1和SB试剂。从诱导方案开始的6天后，有85±1％的诱导细胞表达了典型的NPC标记物，包括SOX1，而70±3％的表达了颈脊髓标记物HOXC4，这表明了脊髓星形细胞的命运（图1A，B）。在存在0.1lMRA的情况下，通过添加浓度为0.5lM的SONICHEDHEHOG（SHH）产生MNPC，其中75±7％的诱导细胞为PAX6阳性在第12天表达MNPC标记OLIG2的表达水平为77±5％（图1C，D）。培养物中检测到了小部分的脊髓腹侧IN祖细胞，其中1.8±0.3％的诱导细胞表达p3域标记NKX2.2,2.5±0.8％的细胞表达p2域标记CHX10（图1E，F）。图1.人类iPSC衍生的运动神经元祖细胞富集群体的产生。
MNPC持续暴露于RA和嘌呤胺导致的细胞富集（67±8％）的诱导细胞群的表达，表达典型的泛MN标记ISL1和HB9（图2A，B）最早发生于25天后。在许多不同的MN衍生实验中，ISL1+/HB9+细胞的产率从40％到高达80％不等（图2B），这可能是从一种培养物到另一种培养物的不同MN存活率的结果。iPSC衍生的ISL1+/HB9+MN的大多数（68±7％）不表达LHX3蛋白而表达FOXP1，通常被认为是侧向运动柱（LMC）的肢体支配性MN的标志物（图2C，D）。在不表达FOXP1的ISL1+/HB9+细胞中，也有15±3％的细胞不表达LHX3，这表明这部分MN的分子特征（FOXP1/LHX3）与外向运动柱（HMC）的MN相似，含有在体内支配呼吸肌的MN（数据未显示）。总之，这些免疫细胞化学观察表明，h-iPSC衍生的MNPCs可以分化成异质性脊椎MNs群体，这些细胞包含表现出提示LMC（68％），HMC（15％）和MMC（11％）MN命运的分子特征的细胞，强调了h-iPSC产生异质MN培养物的能力。图2.通过免疫细胞化学鉴定的人iPSC衍生的运动神经元的不同亚群。
2.使用单细胞RNA测序表征人iPSC衍生的MN培养物的细胞异质性
为了进一步表征源自h-iPSC的MN培养物的细胞组成，我们进行了sc-RNAseq，它能够精确表征单个细胞的全基因组表达谱。我们选择分析第28天的MN培养物，因为在体外分化的这个相对早期阶段，诱导的MN尚未像在继续培养后那样开始聚结成大细胞簇。sc-RNAseq后，从个单细胞中获取FASTQ文件。我们使用Bioconductor软件执行质量控制步骤，以过滤出损坏的细胞，然后对剩余细胞进行主成分分析和t-SNE分析。
质量受控的个细胞被分为14个共享的基于最近邻图的簇（scran），它们表现出不同的基因表达模式，这与h-iPSC衍生的MN培养物中的细胞异质性相符（图3A）。如图3B所示，大多数诱导细胞主要包含在簇＃4（细胞的28％），＃6（15％），＃10（10％）和＃11（9％）中。为了表征鉴定出的簇中的不同细胞类型，我们进行了综合分析，以比较每个簇之间的细胞比例和基因表达差异。根据每个簇中富集的差异基因，鉴定出6种主要类型的细胞（图3C）。簇＃1，＃3和＃11包含大量根据其特定标志物。基于多能性标记物OCTAMERBINDINGPROTEIN4（OCT4）和NANOG（图3D）的高表达，第13号簇的细胞被标注为“未分化的干样细胞”。通过scRNAseq分析而毫发无损的细胞主要富含MNs（35％），INs（28％）和神经胶质细胞（22％）（图3D）。如图3E所示，绝大多数（96.2％）的IN被鉴定为表达SOX14，CHX10和GATA结合蛋白3（GATA3）的V2IN。这些结果表明，在MN分化实验条件下获得并经受sc-RNAseq的hiPSC衍生培养物主要包含MN和V2IN。
图3.通过单细胞RNA测序定义的人iPSC来源的运动神经元培养物的异质组成。3.通过单细胞RNA测序鉴定人iPSC衍生的运动神经元的不同亚型
接下来试图确定衍生自h-iPSC的不同MN亚型。为此我们选择了共同表征为MNPC和/或MN的细胞：NEUROG2，OLIG2，HB9，ISL1，ISL2和CHAT。大多数细胞中存在的线粒体基因百分比少于2％。将个细胞分为8个群集，这些群集显示出不同的基因表达模式，表明MNPC/MN群体具有异质性（图4A）。如图4B所示，大多数细胞主要发现在簇＃2（占细胞的26％），＃1（23％），＃5（20％）和＃6（16％）中。为了确定这些簇中不同的MN亚型，我们进行了综合分析以比较每个簇之间的细胞比例和基因表达差异。根据每个簇中富集的差异基因，鉴定出6种主要类型的细胞（图4C）。群集＃1，＃2，＃5和＃7包含大量被鉴定为LMCMN的细胞，这是基于它们的FOXP1表达和LHX3表达的缺乏（图4D）。相反，被定义为表达LHX3而缺乏FOXP1表达的MMCMNs主要包含在簇＃6和＃8中（图4D）。此外，在簇＃5和＃6中发现了表达HOMEOBOXA5（HOXA5）且缺乏FOXP1和LHX3的脊柱HMCMN（图4D）。为了确认该簇注释，我们搜索了在每种细胞类型中特异性表达的基因，这些基因富含了预期的合适的GO术语（图4E）。这些结果为h-iPSC衍生的MNs的不同亚型，以及正常情况下从未分化祖细胞到定型前体过渡到脊髓中分化的神经元的其他神经细胞类型提供了证据。
图4.用单细胞RNA测序鉴定运动神经元亚型。4.通过单细胞RNA测序鉴定人iPSC衍生的LMC运动神经元的不同亚型
为了表征不同的hiPSC衍生的LMCMN亚型，我们进行了综合分析以比较每个簇之间的ISL1，LHX1和HOX基因表达差异。根据每个簇中富集的差异基因，确定了4种主要类型的LMCMN：“宫颈LMCl”（24％，蓝色），“宫颈LMCm”（33％，橙色），“未成熟子宫颈LMC”，但不是被鉴定为发育更成熟的LMC1或LMCm（34％，紫色）和“腰椎LMC”（5％，粉红色）（图5A）。大部分LMCMN（91％）被鉴定为宫颈LMCMN，共表达HOX6基因和ALDH1A2，并且主要包含在簇＃1，＃2和＃5中（图5B）。相比之下，第7簇中包含的LMCMNs被鉴定为腰椎LMCMNs，缺少HOX6基因并表达HOXD8和HOX9基因，该组仅占LMCMNs的5％，占MNs总数的1.1％（图5C）。在子宫颈LMCMNs中，表达较高水平的HOX5基因和最低水平的HOXC8的最表皮细胞主要包含在簇＃1和＃2中（图5D），而最尾部的子宫颈LMCMNs（HOXC8high/HOX5low）仅限于簇＃1（图5E）。另外，簇＃2和＃7包含表达最高水平的ISL1的细胞，其定义了LMC1MN（图5F）。相反，簇＃1和＃5的细胞表达较高水平的LHX1，从而指定了LMCm神经元（图5G）。如图5H所示，簇＃1包含大部分子宫颈LMC1MN（57％，蓝色），而簇＃2主要包含子宫颈LMCmMN（64％，橙色），簇＃5包含大部分未被鉴定为LMC1或LMCm的子宫颈LMCMN（53％，紫色），腰椎LMCMN占第7组（粉红色）中发现的LMC的41％。
图5.通过单细胞RNA测序鉴定LMC运动神经元亚型。
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