微生物群是共栖，共生和病原性微生物组成的生态群落，它们共享我们的身体空间，其组成随身体位置的不同而不同。考虑到与外部环境的关系，肠道与肠道微生物组（GM）一起充当免疫器官影响免疫系统的发育和维持，进而影响炎症[1,2]。
肠道微生物通过toll样受体信号向先天免疫系统提供刺激，从而保护肠道免受短暂入侵的病原体侵害，toll样受体信号可以增加肠蠕动，增强上皮完整性并产生代谢产物[3,4]。尽管最近人类转基因多样性的改变与多种疾病有关，但在创伤性损伤的背景下，人们所知还很少[5-8]。创伤可以通过多种方式影响肠道，无论是直接损伤肠道，中断脑肠轴，还是通过全身性灌注不足或炎症引起的全身性损害。创伤后对肠道的影响反过来会改变GM，并导致营养不良或肠道微生物的失衡或分布改变[9]。在重症患者中也已表现出快速的营养失调，在长期住院期间的病情恶化被归因于败血症并发症[10,11]。尽管GM多样性的降低与重症患者病死率的增加有关，但创伤对肠道微生物群落的影响的定义尚不明确。在创伤患者中存在明显的营养失调，可能与该人群对诸如多器官衰竭（MOF），医院获得性感染和全身性炎症反应等并发症的敏感性有关[12,13]。在小型患者人群中进行的一些早期临床研究表明，创伤和烧伤后肠道微生物人群的系统发生变化，但这些研究缺乏包括临床相关结果的能力[14-17]。来自各种损伤模型的临床前数据，包括多发伤，烧伤，脑外伤和脊髓损伤，也支持创伤性损伤会改变GM，从而影响转归[16,18–23]。需要更大的临床研究来解决这一差距，并更好地了解损伤后肠道中发生的微生物变化及其与结局的关系。为此，我们对重伤患者进行了一项前瞻性观察队列研究。这项研究的目的是描述创伤患者入院时肠道微生物群落的差异，并开始阐明对临床结果的潜在影响。我们假设，GM的多样性和组成将根据患者的临床病程而有所不同。具体而言，我们评估了经历感染，长时间住院和重症监护病房（ICU）住院或死亡的患者在进入急诊室后是否具有不同的GM特征。2资料和方法在年至年期间，前瞻性招募了因进入钝性或穿透性创伤而严重受伤的成年患者（年龄≥18岁;N=67），这项研究获得了德克萨斯大学圣安东尼奥大学机构审查委员会的批准。该医院是德克萨斯州圣安东尼奥市的一级创伤中心。纳入标准:年龄在18岁或以上，估计的伤害严重度得分（ISS）大于15。排除标准：囚犯，小于18岁的年龄，怀孕以及从外院转入的患者。2.1样本收集前瞻性收集了所有患者的广泛人口统计学，损伤，临床和结局数据。入急诊科（第0天）时通过直肠拭子收集了粪便标本所有粪便样本均在收集样本后的20分钟内保存在-80°C下，以便稍后进行DNA分离。值得注意的是，入组的67例患者中只有3例在进行第二次直肠检查之前接受了抗生素治疗。2.2粪便微生物分析使用QIAGENQIAampDNAStoolMiniKit（QIAGEN，Hilden）从所有粪便样品中分离出微生物DNA。使用ThermoScientificNanoDrop分光光度计对DNA进行定量。然后使用聚合酶链反应，使用定制设计的引物（F27/R），使用提取的基因组DNA扩增16SrRNA基因的V1-V2可变区。准备所有样品的文库，并使用IlluminaMiSeq平台通过配对末端测序（bp）进行测序。随后，原始数据通过软件包QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology（QIIME）处理[30]。2.3统计方法对这些指标的统计分析使用总体方差的方差分析（PERMANOVA）进行，事后成对的PERMANOVAs用于评估各组之间的差异。通过使用Faith_PD和Shannon多样性指数计算观察到的OTU数量（丰富度），OTU丰度的均匀性和多样性，可以估算出α多样性或种群内多样性（个体患者的微生物多样性）。使用Tukey多重比较对方差进行双向分析，以进行α多样性的统计分析。正态分布的数据表示为平均值±SEM，而非正态分布的数据表示为中值±四分位数范围。根据需要使用t检验或进行Mann-Whitney检验并进行Welch校正（当方差不相等时）进行显着性检验。对于所有分析，α0.05被认为是显着的。3结果3.1患者特征特征表明，患者（N=67）主要是男性，平均年龄为45岁，平均ISS为21(见表1)。大多数患者遭受了钝性创伤，只有22％的患者遭受了穿透性损伤。平均±SDBMI为27.0±0.7kg/m2。从受伤现场到急诊科的平均运输时间为29分钟，与死亡患者相比，死亡患者要快得多。死亡的患者年龄较大（p=0.04），受重伤的程度更大，如更大的ISS（p=0.）所示。活着或死亡的患者的性别或BMI没有差异。α-多样性在很大程度上，α多样性的均匀度，Faith_PD和Shannon指数并未揭示大多数不同人口统计学和结果变量的差异。研究表明，老龄化人群的OTU大大增加（图1），这与创伤不太可能相关，因为以前已经在健康个体中证实了这一点[24]。但是，我们发现存活的患者（n=59）与死亡的患者（n=8；p=0.）相比，粪便拭子的OTU有所增加。β-多样性表2中显示了所有β多样性值的显著性水平，图2和图3中显示了所有这些变量的主成分分析（PCA）图，(补充图1至5）。如先前报道，ISS显著影响β多样性，而伤害机制（即钝性与穿透性创伤）则没有影响[9]。根据BMI（p=0.；图2）和性别（p=0.；补充图1），Bray-Curtis差异具有显著聚类。对于其他β多样性指标，许多其他临床上重要的终点和危险因素也明显聚类。分析的每个单个β多样性指标都显示出基于ICULOS的实质性聚类（图2；补充图2）。在PCA图中，更严重的结果与健康对照者相比，更倾向于在空间上聚集。例如，在重症监护室LOS(图2)中，死亡(黑色方块)和重症监护室LOS(蓝色方块)与健康对照组(橙色方块)更接近(图2,补充图3);在肺功能方面，最相关的β多样性指标是Jaccard相似性指数（图2；补充图4）。对于此，在住院期间某个时间出现ARDS的患者在PCA上的聚集方式与未经历ARDS的患者明显不同。此外，根据患者使用呼吸机的时间进行了分组0-3天、4-7天、8-13天或超过14天(图2;补充图4)。令人惊讶的是，四种多样性测量方法中只有一种(未加权的UniFrac)能够根据是否存在感染来区分患者，这可能是由于混合了包括感染在内的并发症(补充图5)。SupplementalFigure1.Significantb-diversityplotsaccordingtoGender.
SupplementalFigure2.Significantb-diversityplotsaccordingtoVentilatordaysandARDS.
SupplementalFigure3.Significantb-diversityplotsaccordingtohospitallengthofstay(LOS).
SupplementalFigure4.Significantb-diversityplotsaccordingtoICUlengthofstay(LOS).
SupplementalFigure5.Significantb-diversityplotsaccordingtoinfection.图3显示了所有β多样性测量的PCA图，将死亡患者与存活患者分开。所检查的每一项措施均能成功识别出死亡患者和未死亡患者之间的住院微生物组差异（p≤0.05）。考虑到死亡组的样本量很小（n=8），并且平均死亡时间为8天，因此所有测量均发现β多样性具有如此显著的差异。此外，死亡患者的GM倾向于与健康志愿者样本中的GM更为接近，而不是存活的患者。与病死率有关的所有系统发育差异都显示在图4,补充图6至9中。存活患者的GM成分的厚壁菌门的相对丰度明显降低（p=0.0）。这些患者倾向于含有更多的细菌。但是，差异无统计学意义（p=0.24）。很大程度上，厚壁菌门的差异可归因于梭菌纲（p=0.）和球菌科（p=0.）的成员(补充图6)。在存活的患者与死亡的患者中，普雷沃氏菌属（p=0.）和棒状杆菌（p=0.）也有所增加（补充图7和8）。最后，死亡的患者和存活患者相比，传统益生菌的肠道微生物组成有所增加。具体而言，在死亡患者的入院粪便拭子中双歧杆菌，黄褐球菌，粘液阿克曼氏菌和草酸杆菌（分别为p=0.、0.、0.和0.）均增加（图4B）。SupplementalFigure6.SignificantchangesinphylogenywithinthephylumFirmicutes.SupplementalFigure7.SignificantchangesinphylogenywithinthephylumBacteroidetes.SupplementalFigure8.SignificantchangesinphylogenywithinthephylumActinobacteria.
SupplementalFigure9.SignificantchangesinphylogenywithinthephylumProteobacteria.4讨论在过去的十年中，显而易见的是，GM可以极大地影响致病状态。GM曾经被认为对肥胖症和糖尿病等代谢综合征具有更大影响力，但现在已经涉及到各种各样急性和慢性疾病。本文中，我们描述了重伤患者的微生物菌群可以根据许多临床重要结果对GM进行分类，医院和ICU住院时间，呼吸机使用时间和病死率。微生物组的重要性已在许多情况下得到证明(如外科手术);然而，微生物组在创伤患者中的特殊作用仅限于创伤后的短暂变化[25]。我们先前对该数据集的研究还表明，变化可能与灌注有关，因为所用血液制品的量会影响细菌的组成[9]。这些患者的平均院前运输时间少于30分钟，入院后30分钟内采集肠道微生物。因此，观察到的差异发生在外伤后1小时内。尽管这不能解决可能对GM造成的临床护理（药物，液体等）的巨大影响，但这凸显了入院微生物组在诸如病死率和LOS等终点具有强大预后价值的潜力。实际上，GM已被描述为将促进精密医学成为现实的关键之一[26]。微生物组研究的挑战之一是在数据解释中使用的快速发展的生物信息学。要实现不同β多样性值的诊断值，很可能需要深入了解这些值之间的细微差别（即UniFrac与Bray-Curtis）。本文提供的数据表明，根据需要的呼吸机持续时间以及他们是否患ARDS，Jaccard指数非常有效地将患者分类。这揭示了以下可能性：这表明，如果患者出现肺功能受损的情况，有针对性地研究Jaccard指数可能是必要的。这些变量之间的细微差别也值得考虑。例如，Bray-Curtis和Jaccard指数是用来量化成分差异的，而Jaccard是基于度量空间的。类似地，虽然UniFrac是比较社区的距离度量，但加权的UniFrac被认为是更定量的，因为它考虑了各种物种的丰度[27]为了进一步强调生物信息处理的重要性，设置诸如采样深度（反射）或OTU相似度之类的变量会极大地影响结果。如果没有标准化创伤领域内数据的处理方式，则应至少努力报告该处理过程是如何进行的。此外，我们在系统发育结果中报告了21种独特的细菌读数（包括相关的微生物，如梭状芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌），当可获得更大的多中心数据集时，这种类型的统计检查将变得非常重要。尽管如此，我们仍然认为，通过分析微生物组而获得的大量丰富信息包含着未开发的有价值信息。尽管样本量很小（n=8例死亡的患者），但发现创伤后死亡的患者与存活者之间存在明显的差异。所有β多样性变量的聚类取决于生存率，而死亡者倾向于与健康个体聚类更紧密。此外，我们发现死亡患者的细菌种群有所不同，包括物种下降。已确定在死亡患者中富集的四种细菌（双歧杆菌，黄曲霉，粘液曲霉和富米酸杆菌）可以作为益生菌在市场上买到。已提出益生菌物种可预防死亡,例如坏死性小肠结肠炎[28]。虽然这些发现的含义尚不清楚，但我们建议死亡的患者可能存在代偿性反应，但最终没有成功。我们的数据还表明，创伤后肠道微生物群落的早期改变可能会为患者带来保护性益处，并在生存和结果中起不可或缺的作用。总而言之，据我们所知，本研究是迄今为止有关创伤患者GM的最大报告。由于外伤造成的病死率与含有较少的独特生物体但含有较多的可获得的益生菌有关。此外，所探测的所有β-多样性参数均能够根据患者是否死于受伤对患者进行分类。尽管其中一些多样性计算也能够对其他重要结果进行聚类，但是具体的关联性不如病死率和所有β多样性参数之间的关联性强。综上所述，GM对于创伤性损伤的诊断和治疗目标具有广阔的前景，还需要进一步的临床和临床前研究。-THEEND-
编译：王理
DOI:10./TA.
DOI:10./TA.东风文献速递-浙大二院急诊医学科文献解读团队