年12月10日/医麦客新闻eMedClubNews/--基因治疗将使医学领域发生革命,为治疗常见和罕见遗传性疾病带来了新希望。在基因治疗这场竞技赛中,腺相关病毒(AAV)载体已经迅速成为体内基因导入主要平台之一(Goswamietal.)1。
由于AAV载体免疫原性和细胞毒性低,能够转导非分裂细胞,并且整合到宿主基因组中的频率非常低,因此被众多研究学者认为安全性更高。经过重组和改造的AAV载体拥有不同的血清型,根据血清型不同而具有不同的宿主范围和病毒特征,可以有效作用于特定细胞类型,包括分裂和非分裂细胞类型。使用者需要根据靶标细胞或者组织类型选择适合的血清型。目前使用频率较高的血清型为AAV2,其它血清型也逐渐被广泛使用。
迄今为止,已有两种AAV基因疗法被FDA批准。第一种为Luxturna,于年获得批准用于治疗莱伯氏先天性黑蒙症,这是一种遗传性视网膜疾病。第二种为Zolgensma,于年获得批准用于治疗小儿脊髓性肌萎缩症。除了以上这两种获得批准的治疗方法外,其他几种AAV疗法已经或者正在世界范围内开展临床试验进行评估。重组AAV载体的安全性和有效性已在多个Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中得到证实。
由于血脑屏障(BBB)的存在,治疗中枢神经系统疾病是非常具有挑战性的。研究发现,许多AAV载体,尤其是AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAV9,对神经元的转导是非常有用的2。因此,许多AAV介导的治疗方法已经或者正在试验中,以治疗溶酶体储存障碍、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、癫痫、1型脊髓性肌萎缩症、异染性脑白质营养不良、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)缺乏症和巴顿病(Goswamietal.)1。
其中芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)缺乏症是一种罕见的神经肌肉疾病,由于DDC基因突变所引起。AADC缺乏症的主要病症是运动障碍,包括自主运动丧失、张力减退、间歇性眼病危象(OGC)和肢体肌张力障碍。AADC缺乏症表现在婴儿早期,严重情况下会使患者终生卧床不起。目前AADC缺乏症还没有特别好的治疗办法,药物治疗只对中度或轻度表型患者有轻微效果,但对大多数重症患者疗效甚微。
截止到年11月,ClinicalTrials.Gov上登记数据显示,开展AADC缺乏症临床试验的项目为4项,目前正处于I期或者II期临床试验阶段,这些研究均使用AAV2作为体内基因导入平台。除此之外,年自治医科大学Kojimaetal.发表了一项I期和II期试验结果3,该试验旨在研究AAV疗法对4-19岁、DDC基因突变患者的影响。作者以AAV为介导导入DDC基因,通过双侧肺输注的方式给药,将表达人DDC基因的临床级AAV载体(由TakaraBioJapan提供AAV载体包装制备服务)作用于6例患者,其中5例是卧床不起的患者。输注后,作者监测了患者的运动、认知和语言功能,同时也监测了由AAV载体引起的任何不良反应。作者发现,6名患者的运动功能都得到了改善,阿尔伯塔婴儿运动量表(AIMS)分数的增加可以证明这一点。在进行基因治疗之前,患者1、4、5和6的AIMS得分为0,患者2的得分为1,患者3的得分为52。接受治疗之后,所有患者的得分均得到改善。接受治疗12个月时,患者3的得分达到了58,是所有患者的最高得分。治疗后,一名卧床不起的患者在助行器协助下能够下床行走,另外两名患者能够在有所支撑的情况下站立。与AADC缺乏症相关的其他病症在所有患者中均有所改善,包括肌张力障碍、多涎、呼吸困难和情绪障碍。在治疗过程中没有观察到严重的不良反应,这表明这种AAV介导的基因治疗对AADC缺乏症患者来说,可能是一种安全有效的治疗方法。这项研究证明了AAV载体在治疗像AADC缺乏症这样的罕见遗传疾病方面是有潜力的。
作为体内基因导入主要平台之一,AAV已经在多个疾病治疗临床试验中显现出有明显的治疗效果,而且不会引起显著的不良免疫反应。比如在REP1基因突变导致的无脉络膜症、CNGB3基因突变导致的色盲或者全色盲、线粒体DNA点突变和ATP生成障碍所引起遗传性视神经病变(LHON)这些遗传性眼科疾病方面,研究结果显示接受AAV基因治疗后患者视力有所提高4,5,6。AAV也是一种广泛应用于癌症基因治疗的病毒载体。多种AAV载体已被用于肿瘤治疗,众多临床前研究结果显示,AAV基因治疗成功抑制肿瘤生长,致使肿瘤消退。另外,AAV还广泛应用于血液病、代谢类等疾病的治疗研究,展现出了广阔的应用前景。
TakaraBio作为先进的生物技术企业,从基础研究到新药开发等领域,我们都可以向生物技术研究和产业支援提供支持。在AAV基因治疗研究领域,TakaraBio具有完善的AAV产品解决方案——从表达、包装、提取到纯化和滴度测定,一站式配齐您的AAV载体研究装备。
无辅助病毒AAV载体制备系统
AAVHelperFreeSystem是一种特别的可制备高滴度AAV的无辅助病毒系统,可提供AAV1型(AAV1)、2型(AAV2)、5型(AAV5)、6型(AAV6)制备系统。我们在该系统的包装载体中引入了一种可提高病毒滴度的人源miRNA(hsa-miR-),与一般只表达Rep基因和Cap基因的pRC2Vector相比,病毒滴度可提高2倍。由于AAV是一种微小病毒,可克隆的目的基因片段大小限制在不超过2.5kb。
强强联合的AAV-CRISPR系统
AAV与CRISPR/Cas9基因编辑技术结合使用,可以通过AAV载体导入CRISPR/Cas9进行基因治疗,可以让更多无望治疗的疾病变成有望治愈,将基因治疗推向了一个新高度。在AAV-CRISPR系统方面,可以提供酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)两种不同来源Cas9的系统。携带酿脓链球菌来源的Cas9(SpCas9)的AAV-CRISPR系统,是一个双载体系统,利用了AAV自身的同源重组特性,在不影响病毒正常制备的情况下,可以将长度约为4.1kbSpCas9基因导入至靶细胞。携带金黄色葡萄球菌来源的Cas9(SaCas9)的AAV-CRISPR系统,是一个单载体系统,使用相对简便。不过需要注意的是,与SpCas9不同,SaCas9所识别的PAM序列为NNGRR(T),N表示任意碱基,R表示A或者G,T具有较强的偏好性。
扩大AAV载体产量必备单品
AAV2倾向于保留在制备细胞中(由于肝素结合域的原因),可以使用专用的提取试剂AAVproExtractionSolution从制备细胞中提取并回收病毒粒子。而其他血清型AAV,更容易释放到培养液中,因此从培养液中分离AAV可以有效扩大AAV载体产量。AAVproConcentrator就是可以从细胞培养上清液中分离浓缩任何血清型AAV载体这样一种简便高效的方法。
与仅涉及AAV颗粒沉淀的其他浓缩方法相比,AAVproConcentrator操作过程中包含了过滤步骤,可以产生更高纯度的AAV载体。而混合-离心的操作流程适用于各种起始量,易于扩展浓缩规模,并且手动操作时间不到一个小时。整个操作过程没有超速离心步骤,使用普通离心机就可完成。我们使用AAVproConcentrator将40ml培养液上清浓缩至μl,病毒滴度可提高95倍,回收率大约为48%。我们通常通过生物学分析方法来检测所制备的AAV载体的感染性滴度,使用AAV载体感染允许细胞(permissivecell)并测定转基因表达量,确定转导单位(TUs)。以MOIs为5,或的浓缩后AAV载体感染靶细胞,其感染效率分别为44.7%或9.2%。
通用简便的AAV载体纯化方式
AAV载体作为体内基因导入的主要平台之一,使用高纯度的病毒粒子是很有必要的,需要去除源自病毒包装细胞和培养基的杂质。即便是将基因导入至培养细胞时,使用纯化后的AAV粒子也可以消除杂质所带来的影响。AAV粒子的纯化通常使用CsCl密度梯度超速离心法或碘克沙醇超速离心法,但这两种方法不仅需要熟练的操作手法,同时还存在耗时长和回收率低等问题。
Takara通用型AAVproPurificationKit不受血清型限制,可以从AAV粒子制备细胞中纯化出AAV粒子,并且可以在4个小时内操作完成。本试剂盒使用了特别的AAV粒子提取方法,省去了冻融和超声破碎等繁琐操作;特别的AAV载体纯化方法,通过简单的操作即可有效去除杂质。我们可提供两种不同纯化规格,方便从不同细胞数量中纯化病毒粒子。通用快速的AAV滴度测定方法
基于qPCR技术开发了通过测定AAV基因组来测定AAV滴度的试剂盒,同以往的DNA印迹法和ELISA法相比,可以更准确、更快速地(2.5小时以内)获得实验结果。AAVproTitrationKit(forRealTimePCR)Ver.2试剂盒中的引物特异针对AAV载体的公共区域AAV2反向末端重复序列(ITR)而设计,如果载体的ITR区域来自AAV2(实际上常用的AAV载体也正是这样的情况),那么无论您制备出的AAV病毒是哪种血清型(取决于病毒包装时所使用的Cap基因),都可以使用这个试剂盒测定病毒滴度。下图所示检测结果表明,对于每个血清型(AAV1、AAV2、AAV6),通过实时PCR扩增CMV区域或者ITR区域所测定的病毒滴度大致相同。如果您不确定该试剂盒是否适用于您的载体,请与我们的技术服务部门联系,并提供您的载体序列。
ReferencesGoswami,R.etal.,Genetherapyleavesaviciouscycle.Front.Oncol.9,doi:10./fonc...HocquemillerM,GierschL,AudrainM,ParkerS,CartierN.Adenoassociatedvirus-basedgenetherapyforCNSdiseases.HumGeneTher.()27:–96.doi:10./hum..Kojima,K.etal.,GenetherapyimprovesmotorandmentalfunctionofaromaticL-aminoaciddecarboxylasedeficiency.Brain42,–().EdwardsTL,JollyJK,GroppeM,BarnardAR,CottriallCL,TolmachovaT,etal.VisualAcuityafterRetinalGeneTherapyforChoroideremia.NEnglJMed.():–8.doi:10./NEJMcSengilloJD,JustusS,CabralT,TsangSH.Correctionofmonogenicand