中华神经科杂志年8月第53卷第8期ChinJNeurol,August,Vol.53,No.8
王丽郝莹段晓慧张瑾顾卫红
医院神经科，北京
王丽现在医院神经内科，北京
通信作者:顾卫红，Email:guweihong
nrdrs.org目的探讨ATXN8OS基因CTA/CTG三核苷酸重复扩展突变患者的临床表型与遗传学特征。方法研究对象为医院神经科运动障碍与神经遗传病研究中心—年收集的例临床拟诊为脊髓小脑性共济失调（SCAs）的患者。首先排除其SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17和DRPLA基因动态突变，之后对ATXN8OS基因非编码区CTA/CTG三核苷酸重复序列进行分析检测，并与名健康对照进行对比。针对携带扩展突变的患者进行临床表型及遗传特征分析。结果共发现有21例患者携带异常扩展的ATXN8OS基因CTA/CTG重复序列，其中CTA/CTG三核苷酸重复扩展≥80次者18例，常见首发症状为走路不稳，逐渐出现言语不清、饮水呛咳，4例患者伴有头部或肢体震颤；CTA/CTG三核苷酸重复扩展70~79次者3例，首发症状为走路不稳，逐渐出现言语不清，尚无饮水呛咳，不伴有震颤。名健康对照的ATXN8OS基因CTA/CTG重复扩展为19~42次。头颅MRI检查21例患者除1例显示胼胝体发育不良外，其余均显示中到重度小脑萎缩，部分患者脑干轻度萎缩。结论携带ATXN8OS基因CTA/CTG重复扩展突变的大部分SCA患者具有共济失调、构音障碍等临床表型，头部MRI显示明显小脑萎缩，提示该突变与SCA8基因相关。脊髓小脑共济失调；基因；突变；表型脊髓小脑共济失调8型（spinocerebellarataxiatype8，SCA8；OMIM：）是由位于13q21的ATXN8OS基因双向转录引起的，其非编码区CTG三核苷酸异常扩展重复和ATXN8基因中的互补CAG异常扩展重复突变导致的SCA亚型，为常染色体性遗传［1］。正常CTA/CTG重复范围为15~50次，与共济失调相关的致病重复长度（高外显率等位基因）通常范围是80~次［2］；但是，有研究者发现一些共济失调患者的重复次数区间跨度很大，可达71~次［3］。SCA8在我国内地为罕见的SCA亚型［4］。目前尚不清楚重复次数50~70是否致病。本研究组收集了例临床拟诊为SCA的患者，在前期首先排除了SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17和DRPLA基因动态突变［5?6］后，检测其ATXN8OS基因动态突变，对其中存在CTA、CTG三核苷酸重复扩展突变患者的临床表型和神经影像学特征进行综合分析，以探讨ATXN8OS基因CTA/CTG三核苷酸重复扩展突变患者临床特点与遗传学特征。资料和方法一、研究对象为医院神经科运动障碍与神经遗传病研究中心—年收集的例临床拟诊为SCA的患者及名健康对照（来自医院体检血样，均无遗传病家族史）。排除感染、中*、缺血、代谢、免疫或肿瘤等继发性原因。本研究为横断面研究，已经过医院伦理委员会审核批准（批号：?39），所有受试者及其家属均知情同意并签署知情同意书。二、研究方法1.临床资料收集：由2名神经内科专科医师对所有患者进行详细的临床资料登记（包括性别、年龄、病史、家族史等）并进行全面的神经系统体检，观察头部MRI，重点观察脑干和小脑萎缩程度。2.全血基因组DNA提取：经受试者及其家属知情同意，空腹采集其外周血5ml，以质量分数为3.8%枸橼 进行抗凝，采用标准酚氯仿DNA提取法提取基因组DNA。首先排除SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17和DRPLA基因动态突变。3.ATXN8OS基因CTA/CTG重复片段PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物：根据ATXN8OS基因3′端非翻译区CTA/CTG三核苷酸重复片段两侧序列设计引物，由北京赛百盛基因技术有限公司进行合成，正向引物（F引物）序列：5′?GGTCCTTCATGTTAGAAAACCTGGCT?3′；反向引物（R引物）序列：5′?TTTGAGAAAGGC?TTGTGAGGACTGAGAATG?3′。PCR反应体系制备方法：依次加入脱氧核糖核苷三 （dNTPs）2.50mmol，2×GC缓冲液Ⅰ12.50μl，引物各5pmol，模板DNAng，r?Taq1U，加灭菌去离子水补充至25μl；反应条件为94℃预变性5min，第1相循环时，以94℃变性40s，起始退火温度66℃30s，以后每个循环降低0.5℃，72℃延伸1min，共循环20次；第2相循环时，以94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸1min，共循环10次， 72℃延伸10min终止反应。PCR扩增产物以质量浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳，V电压电泳50min，对于出现2个电泳条带的样本进行毛细管电泳片段分析。4.基于毛细管电泳的片段分析：对上述电泳中出现2个电泳条带的样本进行进一步的毛细管电泳。采用荧光标记法进行PCR检测，引物序列包括ATXN8OS?F荧光引物（即上述正向引物经D4荧光标记，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）以及上述反向引物（R引物）。PCR反应体系为dNTPs2.50mmol、2×GC缓冲液Ⅰ12.50μl，正向和反向引物各5pmol，模板DNAng，r?Taq1U，加灭菌去离子水补充至25μl。采用美国BeckmanCoulter公司生产的CEQ?核酸分析仪对PCR扩增产物进行片段分析：取20μl 胺，0.25μlCEQDNASizeStandardkit?片段作为标准内标，1μlPCR扩增产物混匀后上样；预设程序进行电泳分离，分离条件为毛细管温度达50℃时，90℃变性s，2kV电压下注入样本30s，4.80kV电压下电泳70min，以预设的分析参数进行片段分析。三、统计学方法采用SPSS17.0统计学软件进行数据处理与分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示。结果一、ATXN8OS基因CTA/CTG重复序列检测经基因检测，我们发现例临床拟诊SCA病例中有21例患者携带异常扩展的ATXN8OS基因CTA/CTG重复序列（图1），其中CTA/CTG三核苷酸重复次数≥80次者18例，包括男10例，女8例，发病年龄6~57岁［（27.33±16.10）岁］，病程0.5~10.0年［（4.03±2.85）年（表1）］；重复次数70~79次者3例，男2例，女1例，发病年龄和平均病程见表2。名健康对照ATXN8OS基因CTA/CTG重复次数为19~42次（图1D中黑框区域）。二、ATXN8OS基因CTA/CTG三核苷酸重复扩展突变患者的临床特征21例患者中7例为SCA8家系中的先证者；14例无明确的家族史，其中1例患者为近亲婚配后代（家系图见图2）。现对21例ATXN8OS基因CTA/CTG三核苷酸重复扩展异常患者的临床表型分析如下：ATXN8OS基因CTA/CTG三核苷酸重复扩展异常发病的患者临床表型差异较大，CTA/CTG三核苷酸重复扩展≥80次组（表1）常见的首发症状为走路不稳，逐渐出现言语不清、饮水呛咳，4例患者伴有头部或肢体震颤。CTA/CTG三核苷酸重复扩展70~79次组（表2）首发症状为走路不稳，逐渐出现言语不清，尚无饮水呛咳，不伴有震颤。神经系统体检常见体征包括：肢体共济失调、构音障碍、步态共济失调，部分症状严重的患者合并有腱反射亢进及病理征阳性。CTA/CTG三核苷酸重复扩展≥80次组（表3）中7例患者伴有眼球震颤，5例患者病理征阳性，2例患者伴有慢眼动，3例患者伴有震颤。4例患者表现为痉挛步态，1例患者有弓形足，2例患者伴有脊柱侧弯畸形，1例患者伴有双足内翻畸形。CTA/CTG三核苷酸重复扩展70~79次组（表4）不伴有震颤、畸形和慢眼动，1例患者伴有眼球震颤。三、ATXN8OS基因CTA/CTG三核苷酸重复扩展异常患者神经影像学特征除CTA/CTG三核苷酸重复扩展≥80次组中的例5（临床表现为痉挛性截瘫）的头部MRI显示胼胝体发育不良（图3）外，其余患者的头部MRI均显示明显小脑萎缩（图4），部分患者脑干轻度萎缩伴第四脑室扩大（图5）。讨论与SCA8表型相关的重复扩增涉及2个相互重叠的基因：ATXN8OS和ATXN8［7］。在CTG方向，ATXN8OS基因表达包含CUG重复扩增的转录物。在CAG方向，ATXN8基因表达多聚谷氨 （polyGln）和多聚丙氨酸（polyAla）重复扩增蛋白。PolyGln蛋白聚集在浦肯野细胞的细胞核中［7］。由重复扩增相关的非ATG（RAN）基因翻译所表达的polyAla扩增蛋白在患SCA8的人及小鼠大脑中也存在聚集［8?9］。CUG重复扩增基因转录物引起*性RNA［10］和*性RAN蛋白过表达很可能导致SCA8发病［11］。SCA8外显率降低的分子机制目前尚不完全清楚，可能与以下特征相关：重复越长，越有可能导致从阅读框架中表达的RAN蛋白混合物的积聚，也有可能导致疾病严重程度的增加。RAN翻译模型表现出重复长度依赖和对发卡或二级RNA结构的偏好。阐明SCA8中RAN蛋白的机制和作用非常重要，有助于找到切断致病途径的有效治疗方法［9，12］。SCA8的确诊依赖于检出ATXN8OS（一般称为SCA8基因）CAG/CTG异常重复扩增。具有致病性的（CTG）n与不致病但具有高度多态性且稳定传代的（CTA）n相邻，使得确定致病性（CTG）n准确的重复次数较为困难。所以，现有的参考范围是基于（CTA）n和（CTG）n重复的总数量来制定的。Juvonen等［13］通过研究发现，可以80~次CTA/CTG重复作为诊断SCA8的标准，但SCA8比其他SCAs的遗传特征更为复杂，外显率低，不是所有携带致病基因异常扩展的个体都会发病［14］。另外，ATXN8OS基因重复序列在遗传上是“不稳定的”，代间传递时重复的次数可能会扩展或缩短。因此，对于存在该不稳定重复基因的家系来讲，有几种潜在的结果：①亲代未患病，CTG重复的数量可能会扩展，从而导致后代发病；②亲代患病，重复的次数可能会缩短，后代不会患病；③患病的亲代可能有患病的后代；④未患病的亲代可能有未患病的后代。（CTA）n（CTG）n复合体中的（CTG）n部分不稳定，在母系遗传时倾向于扩增［15］（如CTA/CTG三核苷酸重复扩展70~79次组中的例2有家族史，CTA/CTG重复次数为29/78次，其女为32/79次，出现行走不稳）；但在父系遗传时倾向于缩短［16］（如CTA/CTG三核苷酸重复扩展≥80次组中的例2无家族史，CTA/CTG重复次数为20/99次，其父亲为25/次，但无相关症状及体征）。在患有SCA8的男性精子中，几乎所有扩增的等位基因都存在重复序列缩短。精子的重复序列缩短现象有可能与父系遗传时外显率降低有关［7］。总之，重复序列的代间变化似乎在SCA8的外显率降低中起一定作用，共济失调更可能来自较大的母系遗传的重复序列，而不是较小的父系遗传的扩增序列。CTA/CTG三核苷酸重复扩展≥80次中的例11无家族史，CTA/CTG重复次数为/次（图1B）。因此，通常情况下，SCA8家族史给人的印象是该疾病是散发性的（无家族史）或以常染色体隐性方式遗传。SCA8临床特点为缓慢进展性共济失调。常见的初期症状包括行走不稳、构音障碍和语速缓慢。部分患者会出现眼球震颤和其他异常眼球运动［17?18］。通常成年期发病，持续几十年，一般不会影响寿命。本研究中13例患者表现为共济失调步态，4例患者表现为痉挛步态，4例步态无明显异常。CTA/CTG三核苷酸重复扩展≥80次组中的例4（图1A）为男性，20岁，双下肢无力5年，神经系统体检表现为痉挛性截瘫，头部MRI显示胼胝体发育不良，未见明显小脑及脑桥萎缩，这可能是导致其临床症状与典型SCA8不一致的解剖学基础。提示携带异常SCA8基因重复扩展的患者临床表型变异较大，外显不全。此外，已在散发的多系统萎缩［19?20］、帕金森病［21?22］、进行性核上性麻痹［23］、阿尔茨海默病［24］和肌萎缩侧索硬化［25］患者中，甚至极少数的正常人中，都有发现SCA8异常重复扩展。因此，异常的CAG/CTG扩展仅是SCA8的诊断的必要但不是充分条件。支持SCA8诊断的指标包括：进行性小脑性共济失调表现；小脑体征；共济失调阳性家族史；磁共振成像显示小脑萎缩；尤其是伴有锥体束损害和认知功能下降［26］。我们未在健康对照中发现重复扩展等位基因携带者。携带有大于50个复合重复序列长度的个体虽然在一生中具有出现共济失调的风险，但是该疾病外显率的降低意味SCA8相关的重复扩展的存在并不能用于预测子代是否会出现SCA8症状［27］。总之，本研究结果提示，携带ATXN8OS基因CTA/CTG重复扩展突变的大部分患者具有共济失调、构音障碍等临床表型，头部MRI显示明显小脑萎缩，提示该突变与SCA8相关。广大医务工作者应该提高对本病的认识，中青年起病的走路不稳患者，即使没有明确家族史，也要进行ATXN8OS基因相关检测，提高诊断率。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突作者贡献声明王丽：家系临床资料收集，采集血样标本，分析基因检测结果，撰写论文；郝莹：整理临床资料和DNA标本库，进行基因检测及致病位点分析，统计分析；段晓慧：家系临床资料收集，分析基因检测结果，统计分析；张瑾：家系临床资料收集，进行基因检测及致病位点分析，参与撰写论文；顾卫红：家系临床资料收集，组建DNA标本库，分析基因检测结果，审阅和修改论文喜欢本文，