由于致病性STR扩增等位基因的大小和序列构象具有多样性，其涉及的疾病种类较多且患病率较高。利用现有分子技术进行分析往往出现耗时长、诊断不准确的情况，因此急需改进STR分子的表征方法。此外，许多致病性STR扩增的复杂度和高GC含量使得其难以通过短读长测序进行分析。
近日，悉尼加文医学研究所研究团队在ScienceAdvances发表了题为“Comprehensivegeneticdiagnosisoftandemrepeatexpansiondisorderswithprogrammabletargetednanoporesequencing”的文章。研究团队通过对牛津纳米孔技术公司（ONT）具有“ReadUntil”功能的测序设备进行了编程，使其能够检测 0个已知的STR扩增疾病相关基因，解决了分子检测和短读长测序中复杂的STR扩增问题。此外，研究团队还对37位患者的DNA样本进行了靶向ONT测序，进一步证实了可编程ONT测序在STR基因诊断中的有效性和实用性。
文章发表在ScienceAdvances上ONT的ReadUntil功能可对所有已知的致病性STR基因座进行简单、经济、高效的测序。为了评估ReadUntil在STR分析中的应用，研究团队首先使用开源软件包Readfish对37个基因组的DNA样本进行了靶向测序（图1）。将基因组DNA剪切成15~25kb的片段，并在ONTMinION流通池上进行测序。结果显示，与目标reads（N50=12.5kb）相比，非目标reads（N50=2.5kb）的片段长度不断减少，表明ONTReadUntil可以准确排除目标区域以外的片段。此外，ONTReadUntil还实现了与全基因组ONT测序相似的覆盖深度（图1）。
图1.用ONT-ReadUntil靶向已知致病性STR位点。来源：ScienceAdvances
为确定可编程靶向ONT测序的有效性和实用性，研究团队分析了25例来源于不同神经遗传疾病患者的DNA样本，包括HD、FXS、CANVAS、脊髓延髓肌萎缩症（SBMA）、强直性肌营养不良型1型（DM1）、神经元核内包涵体病（NIID）、弗里德赖希共济失调（FRDA）；肌萎缩侧索硬化症（ALS）、脊髓小脑共济失调1型（SCA1）、眼咽肌营养不良症（OPMD）。
亨廷顿病
HD是一种神经退行性疾病，由基因HTT内多聚谷氨 STR扩增大量异常重复的“CAG”基序引起，因此HD的基因诊断需要准确的等位基因特异性STR测定。分析结果显示，通过ONTReadUntil测序确定的STR等位基因长度与临床试验中检测到的长度完全一致。
脆性X染色体
脆性X染色体综合征是一种不完全外显性X连锁显性遗传病，男性患者占比较多且症状较重。脆性X染色体综合征的致病基因为FMR1，含有“CGG”三核苷酸重复序列。此外，FMR1相关疾病的致病机制也与DNA 化（5mC）有关（图2）。因此，除了检测STR的大小和内部序列外，FMR1相关疾病的完整基因诊断还需要DNA 化分析。分析表明，ONTReadUntil测序能正确地将受影响的男性个体、女性携带者与未受影响的个体区分开来，并将突变前等位基因与完全致病性STR扩增区分开来。
图2.HTT和FMR1的单倍型解析组装和DNA 化分析。来源：ScienceAdvances
小脑共济失调、神经病变和前庭反射综合症
CANVAS是一种神经退行性运动障碍，多数由基因RFC1中的双等位基因“AAGGG”STR扩增引起。但RFC1中扩增的STR等位基因具有不同的基序构象，除了典型的致病基序“AAGGGexp”外，“ACAGGexp”基序和混合“AAAGG10-25AAGGGexp”构象都被认为是致病的（图3）。所以需要以等位基因特异性的方式解析STR扩增，这对CANVAS患者的基因诊断具有挑战性。
研究团队使用ReadUntil对6例CANVAS患者进行了靶向测序。结果显示，与传统测序方法相比，ONTReadUntil测序很容易区分两个STR等位基因，识别出不同的“AAGGG”、“AAAGG”构象，突出了ONTReadUntil测序分析较大、较复杂STR的实用性。
图3.STR等位基因的多样性。来源：ScienceAdvances
SBMA、DM1、NIID、FRDA、ALS、SCA1和OPMD
为进一步证明ONTReadUntil测序的广泛实用性，研究团队对SBMA、DM1、NIID、FRDA、ALS、SCA1和OPMD患者进行深度分析。结果显示，在所有情况下，ONTReadUntil测序都能够正确地对相关STR进行基因分型（图4）。上述结果表明，靶向ONT测序能够对神经致病性STR位点进行准确地单倍型分辨定量、序列测序和DNA 化分析，为STR扩展障碍导致疾病的基因诊断提供了新的研究方法。
图4.致病性STR位点RFC1的单倍型解析组装。来源：ScienceAdvances药物基因组分析
除了疾病相关STR基因外，研究团队还通过ONTReadUntil测序分析了28个药物基因组（PGx）基因。许多PGx基因都具有高度多态性，常存在结构变异，并具有紧密的同源性，因此难以使用标准分子技术或短读长测序对其进行基因分型。与短读长测序不同，ONTReadUntil测序实现了CYP2D6及其邻近假基因CYP2D7的完全覆盖和定相（图5）。
图5.PGx基因的靶向测序。来源：ScienceAdvances
综上所述，该研究证明了可编程靶向纳米孔测序在STR扩增障碍基因诊断中的有效性和实用性。与现有的分子技术不同，ONTReadUntil测序能够在单一靶向分析中对所有已知的神经源性STR位点进行无偏大小和序列的测定，实现了全基因组纳米孔测序类似的目标覆盖率，降低了样本成本、数据存储和计算要求。ONTReadUntil测序有望成为STR基因的研究利器，并为许多尚未解决的病例提供分子诊断新方法。
参考文献：StevanovskiI,ChintalaphaniSR,GamaarachchiH,etal.Comprehensivegeneticdiagnosisoftandemrepeatexpansiondisorderswithprogrammabletargetednanoporesequencing.SciAdv..扩展阅读：AHSJ纳米孔测序电子靶向测试技术帮助鉴定出传统技术未检出的致病变异Readfish
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