01
常规生化检测技术
常规生化检测技术包括血糖、肝功能、肾功能、电解质、血脂、肌酸激酶、血氨及乳酸等。虽然这些检测不具有特异性，检测结果异常，并不能诊断为某种遗传代谢病，但常常为一些遗传代谢病的诊断、鉴别诊断或选择进一步的检测方法提供依据。如血糖降低需要鉴别的遗传代谢病有糖原累积病、高胰岛素血症及脂肪酸氧化代谢病等。肝功能异常需要鉴别的遗传代谢病有糖原累积病、Citrin蛋白缺乏症、酪氨酸血症、肝豆状核变性、胆汁淤积性肝病等。电解质紊乱如高血钾、低血钠常提示肾上腺疾病，如先天性肾上腺皮质增生症、肾上腺皮质功能不全症、甘油酸激酶缺乏症及醛固酮受体不敏感综合征等；高血氨常提示尿素循环障碍性疾病、有机酸血症及脂肪酸氧化代谢病等。
02
特殊生化检测
特殊生化检测是指除血糖、肝功能、肾功能、电解质、血脂、肌酸激酶、血氨及乳酸检测外的一些生化检测，主要包括血串联质谱检测、尿气相色谱-质谱检测、血维生素检测、微量元素检测及尿蝶呤检测等。2.1血串联质谱检测串联质谱技术是通过检测物质的质荷比（质量数/所带电荷数）对物质进行定性及定量的仪器。年美国Millintong教授将此技术用于遗传代谢病检测［1］，其优点在于检测方法快速、特异性强，能够在2min之内通过检测干血滤纸片中数十种氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平，对40余种氨基酸、有机酸及脂肪酸氧化代谢病进行新生儿筛查、临床患者的诊断及鉴别诊断，且可设置相关氨基酸及酰基肉碱之间的比值，进一步降低检测结果的假阳性或假阴性。另一优点是采用干血滤纸片采样，利于采集、保存及递送。串联质谱技术于上世纪末及本世纪初在一些发达国家广泛应用于新生儿筛查［7-9］。医院率先将串联质谱技术应用于新生儿疾病筛查及临床患者检测［10］。目前国内约有50余家单位开展此项技术，已经诊断数千例患者。血串联质谱检测结果分为氨基酸谱及酰基肉碱谱2部分，包括10余种氨基酸及其相互间的比值、20余种酰基肉碱及其相互间的比值。部分疾病只需要一种氨基酸或一种酰基肉碱异常，即可提示或诊断；部分疾病需要几种氨基酸、或几种酰基肉碱异常才可提示或诊断。2.1.1血氨基酸水平异常血氨基酸水平异常分为增高和降低两大部分。血氨基酸水平增高提示的遗传代谢病较多，且多与氨基酸代谢病有关，见表1。由于部分氨基酸代谢病患者尿中相应的有机酸可增高，如枫糖尿病患者尿中2-羟基异戊酸、2-酮异戊酸、2-酮-3甲基戊酸、2-酮异己酸增高，瓜氨酸血症或精氨酸血症尿中乳清酸及尿嘧啶可增高，故血中某种氨基酸增高的同时，尿气相色谱质谱检测对应的有机酸增高，更有助于诊断。但尿有机酸检测不能作为氨基酸代谢病的单一确诊指标。血氨基酸水平降低提示的遗传代谢病较少，多见于营养不良或早产儿。血瓜氨酸水平降低，需要结合血氨水平分析，若血氨显著增高，则提示鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症，或氨甲酰磷酸合成酶缺乏症，这2种疾病的鉴别需要测尿乳清酸及尿嘧啶水平，若尿乳清酸及尿嘧啶水平增高可诊为鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症，若尿乳清酸及尿嘧啶水平正常则要考虑氨甲酰磷酸合成酶缺乏症，但也不能排除鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症，还需要行基因检测以做鉴别。蛋氨酸水平降低，则提示同型半胱氨酸尿症，或甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症，需要测血同型半胱氨酸水平进行鉴别。2.1.2血酰基肉碱水平异常串联质谱既可检测血游离肉碱，又可检测结合的肉碱暨不同长度碳链的酰基肉碱，从乙酰肉碱至十八碳酰基肉碱。游离肉碱及酰基肉碱是体内有机酸及脂肪酸代谢的重要中间产物。体内的有机酸或脂肪酸在代谢过程中产生的有机酸，生成酰基辅酶A，在相关酶的作用下与肉碱结合成酰基肉碱，再进一步代谢，有利于体内有机酸的排除及脂肪酸的氧化代谢。若由于遗传因素或其他因素导致相关的酶的活性降低，相应的游离肉碱或酰基肉碱的水平增高或降低，故可通过检测血游离肉碱及酰基肉碱水平的高低，判断是由哪一种酶活性降低，从而提示是哪一种疾病［8-12］。游离肉碱或酰基肉碱显著异常者，在排除其他疾病的情况下，可诊断相应的疾病，轻度异常者，可能是继发性改变，需要反复检测，或基因检测进行鉴别诊断。血游离肉碱及酰基肉碱增高提示的遗传代谢病较多，且多与有机酸血症及脂肪酸氧化代谢病有关，见表2。由于一种酰基肉碱增高，可提示多种有机酸血症，但这些疾病尿中都有特异性的有机酸，故需要同时检测尿气相色谱-质谱，若对应的特异性有机酸增高，才可诊断［13］。而脂肪酸氧化代谢病中多种疾病可表现为相似的酰基肉碱谱改变，尿气相质谱检测脂肪酸氧化代谢病也无特异性，需要基因检测进行鉴别诊断。血游离肉碱及酰基肉碱降低提示的遗传代谢病相对较少，主要是游离肉碱显著降低，同时伴有其他酰基肉碱降低提示原发性肉碱缺乏症，是由于编码肉碱转运蛋白的基因发生突变，导致肉碱转运蛋白功能降低，食物中的肉碱不能吸收入血液所致。但对于母乳喂养的新生儿或婴儿，需要测母亲血游离肉碱，因为若母亲患原发性肉碱缺乏症，母乳中游离肉碱含量低，导致其子为继发性肉碱缺乏，故母乳喂养的婴儿血游离肉碱降低时，一定要测母亲血串联质谱，以便排除母源性肉碱缺乏症。游离肉碱及其他酰基肉碱轻度降低多为继发于营养不良、长期素食、反复呕吐、腹泻或其他疾病消耗肉碱所致，如有机酸血症、脂肪酸氧化代谢病等。2.2尿气相色谱-质谱检测气相色谱质谱技术也是通过检测物质的质荷比对物质进行定性和定量检测，主要是通过检测尿液中数十种有机酸水平的高低，判断是否为遗传代谢病［2，14-15］。由于尿液中有机酸的含量变化较大，且同时检测数十种有机酸，故多为半定量检测，较难做到全定量检测，故不能用于新生儿疾病筛查，可以作为临床患者，或新生儿串联质谱筛查阳性患者的辅助诊断指标。由于体内有机酸水平受尿液采集当天及前几天的饮食、疾病状态影响较大，会导致尿液中相关的有机酸轻度增高，属于继发性改变，并不是对应的遗传代谢病所致。由遗传代谢病所致尿有机酸常显著增高。对于轻度增高者不能轻易进行诊断，需要结合血串联质谱检测的氨基酸、酰基肉碱水平及其他实验室结果综合分析，且需要反复检测，或进行基因检测，以免过度诊断。另外，部分有机酸血症血氨基酸或酰基肉碱正常，如甘油酸激酶缺乏症及尿黑酸尿症等［16-17］。尿有机酸增高是诊断有机酸血症的主要依据。因为有机酸血症患者体内产生大量的有机酸，有机酸的蓄积对人体是有害的，故有机酸血症时产生的有机酸会大量由尿液排出，尿液中有机酸显著增高。尿有机酸增高提示的有机酸血症见表3。大部分有机酸血症患者急性期尿液中相关的有机酸显著增高，同时伴其他多种有机酸继发性增高，病情稳定期主要是相关有机酸增高，发作期伴发的其他有机酸降至正常。部分氨基酸代谢病及脂肪酸氧化代谢病尿中相关的有机酸增高，但稳定期或病情较轻患者尿中有机酸可正常，这是由于氨基酸代谢病及脂肪酸氧化代谢病病情稳定或较轻时，机体内有机酸无增高，故尿液中有机酸也正常。尿有机酸增高提示的氨基酸代谢病、脂肪酸氧化代谢病及其他疾病见表4。2.3其他特殊检测2.3.1肾上腺皮质激素水平检测主要用于检测肾上腺性疾病的诊断。2.3.2尿蝶呤检测主要通过检测尿新蝶呤、生物蝶呤及其比值，鉴别高苯丙氨酸血症的类型。03
酶活性检测技术
3.1溶酶体酶活性检测溶酶体酶含有数十种酶，参与溶酶体的代谢。若这些酶活性降低，会引起不同类型的溶酶体病，目前较常见的溶酶体病包括：黏多糖病、糖原累积病-Ⅱ型、戈谢病、尼曼匹克病及法布雷病等［5］。由于目前患者的体液中尚不明确是否存在特异性的标志物或还没有检测这些标志物的方法，故不能用生化的方法检测此类疾病，只有通过检测相关的酶活性或基因诊断，才能确诊。溶酶体酶活性检测方法是通过在外周血白细胞或羊水细胞中加入底物，计算产物与底物比值，计算酶的活性。对于检测结果酶活性降低的患者需要基因检测，进行验证。目前已有部分国家及地区利用此方法进行新生儿溶酶体疾病筛查［5，18］。3.2生物素酶活性检测检测外周血干血滤纸片中生物素酶的活性，用于诊断生物素酶缺乏症，已在一些国家用于新生儿生物素酶缺乏症的筛查。3.3血二氢生物蝶啶还原酶检测用于高苯丙氨酸血症患者鉴别是否为二氢蝶啶还原酶缺乏症。04
基因检测
4.1第一代测序技术第一代基因测序技术即目前常用的Sanger基因突变测序技术，临床已经应用了30余年，为临床疾病诊断提供了很大帮助。即利用外周血，或者各种体液中的细胞或组织细胞的DNA，进行PCR扩增，然后利用基因测序仪进行检测，检测结果为基因序列的点突变，包括碱基替换、插入或缺失。其优点是能够检测点突变，特异性强，缺点是成本高、测序速度慢，且不能检测基因大片段的缺失和重复。故主要用于因点突变所致的单基因遗传病的检测，如氨基酸代谢病、有机酸血症、脂肪酸氧化代谢病、糖原累积病及溶酶体病等。不能用于因基因片段缺失所致的疾病检测，如肌营养不良、脊肌萎缩症。4.2新一代测序技术新一代测序技术指近10余年建立的二代及三代测序技术，由于对测序方法的改进，使测序速度有了很大提高，其最大优点是高通量，能够同时对几十个基因进行快速测序，显著降低检测成本。在临床应用中，对于与多个基因相关的疾病的基因诊断更有意义［19］。如糖原累积病有十几种类型，若用第一代测序技术，需要分别对每一个相关基因进行测序，检测费用高，检测时间较长，而利用新一代测序技术可以同时对这十几个基因同时测序，检测费用降低，检测时间缩短，更有助于临床疾病的诊断。目前由于新一代测序技术临床应用时间较短，对于检测到的疑似致病突变，尚需要再进行传统测序方法进行验证。05
染色体检测
5.1染色体核型分析染色体核型分析目前仍然是对一些外观多发畸形患者进行病因诊断的一种常用方法，包括先天愚型（唐氏综合征）、多器官畸形及性发育异常等。但由于染色体核型分析分辨率的限制，只能检测染色体数目及染色带的异常，不能检测单个基因的缺失或异常。故近10余年又发展了多重连接依赖探针扩增技术（multiplexligationdependentprobeamplification，MLPA）、基因芯片技术，这些技术可以检测一些微小的基因片段缺失。5.2荧光原位杂交技术（FISH）可以准确定位基因组中多个同源位点，结果直观、可靠。只能有针对性地检测已知目标DNA变异区域，无法发现未知的染色体变异区域，2kb以下的cDNA序列很难定位。FISH检测操作要求高，结果需要有经验的细胞遗传学家进行分析。5.3MLPAMLPA是近10余年发展的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。该技术高效、特异，在一次反应中可以检测45个核苷酸序列拷贝数的改变，主要检测染色体数目非整倍体异常、基因或基因片段的缺失或重复及基因甲基化检测，主要应用于由于染色体异常或基因大片段缺失所致疾病的检测，如肌营养不良、地中海贫血、先天性肾上腺皮质增生症、DiGeoge综合征及某些肿瘤等可能与基因缺失相关的疾病。其缺点是不能检测染色体平衡易位、不能检测点突变、不能用于单个细胞的检测。故对于某些遗传代谢病若检测不到基因突变的情况下可进行MLPA检测，以便发现基因片段缺失。5.4基因芯片检测基因芯片技术是通过制备好的含有大量寡核苷酸探针的芯片与待测样品的DNA进行杂交，检测染色体片段是否正常，进行遗传病检测。其优点是可在全基因组范围内检测到染色体片段的缺失和增加并能准确地测定其大小；可同时检测多种因染色体失衡而导致的疾病，且分辨率高，相比传统核型分析高出近千倍。基因芯片的缺点是不能检测点突变和平衡易位，虽然少数特制芯片可以检测到点突变，但仍不如基因直接测序更准确。目前主要用于不明原因智力落后、发育迟缓、孤独症、不明原因综合征及多发畸形等。美国医学遗传协会已将基因芯片检测作为了多发畸形等几种疾病的一线检测首选技术［20］。总之，目前有较多的遗传病检测技术可以选择，临床医生需要根据患者的临床表现，基本的实验室检测结果及其他影像学检测结果，综合分析患者疑似的疾病，合理的选择检测方法，达到即快速诊断，又能节省费用的目的。参考文献
［1］MillingtonDS，KodoN，NorwoodDL，etal.Tandemmassspectrometry:anewmethodforacylcarnitineprofilingwithpotentialforneonatalscreeningforinbornerrorsofmetabolism［J］.JIn?herMetabDis，，13:-.··
ChineseJournalofPracticalPediatricsAugust.Vol.29No.8
［2］TanakaK，BuddMA，EfronML，etal.Isovalericacidemia:anewgeneticdefectofisoleucinemetabolism［J］.ProcNatlAcadSciUSA，，56:-.
［3］ChengJ，FortinaP，SurreyS，etal.Micro-chip-baseddevicesformoleculardiagnosisofgeneticdisease［J］.MolDiagn，，1:-.
［4］YongguoYu，Bai-linWu，JieWu，etal.Exomeandwhole-ge?nomesequencingasclinicaltests:atransformativepracticeinmoleculardiagnostics［J］.ClinChem，，58:-.
［5］SpacilZ，TatipakaH，BarcenasM，etal.High-throughputassayof9lysosomalenzymesfornewbornscreening［J］.ClinChem，，59:-.
［6］YeJ，GuXF，QiuWJ，etal.Diagnosis，treatment，follow-upandgenemutationanalysisinfourChinesechildrenwithbiotinidasedeficiency［J］.JInheritedMetabDis，9，32:S-.
［7］SchulzeA，LindnerM，KohlmullerD，etal.Expandednewbornscreeningforinbornerrorsofmetabolismbyelectrosprayionization-tandemmassspectrometry:results，out